Après "l'étrange village", le Professeur Layton et son assistant Luke se trouvent confrontés à la disparition du Dr. Schrader, le mentor du célèbre archéologue au chapeau. Celui-ci confie dans une lettre adressée à son ancien élève avoir mis la main sur la célèbre boîte de Pandore, censée causer la mort de quiconque ose l'ouvrir. Inquiet, le professeur Layton se rend chez le Dr Schrader. Arrivé trop tard, il découvre son ancien mentor sans vie et constate la disparition de la fameues boîte. Pour découvrir la véritable cause de la mort du Dr Schrader, Layton et Luke n'ont qu'un seul indice : un billet de train pour le Molentary Express qui ne possède aucune destination.

A l'instar du premier volet, Professeur Layton et l'étrange village, le studio japonais Level-5 plongera une fois encore le joueur dans un monde où la logique règne. Méninges et observations seront de rigueur pour déjouer les pièges contenus dans cet épisode. Celle-ci conservera également l'ambiance du premier opus avec des séquences animées et des graphismes dans la veine du film d'animation Les Triplettes de Belleville de Sylvain Chomet. Petit bonus, les joueurs qui ont fini Professeur et l'étrange village pourront obtenir un code secret qui servira à débloquer une énigme bonus dans sa suite.